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Association de cellules mononucléaires périphériques contenant de l’ADN de Chlamydia pneumoniae avec un syndrome coronarien aigu et une maladie coronarienne stable chez des sujets japonais

Pour clarifier l’association de l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les cellules mononucléaires du sang périphérique avec les SCA avec syndrome coronarien aigu et la coronaropathie stable chez les adultes japonais, la réaction en chaîne de la polymérase a été utilisée pour détecter la présence de l’ADN de C. pneumoniae L’ADN dans les PBMC était similaire dans une comparaison des patients% avec ACS, patients% avec CAD stable, et les sujets témoins% Changements temporels dans la prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans PBMCs ont également été évalués tous les mois pendant une période n = La prévalence était En conclusion, la prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC chez les patients atteints de SCA ou de CAD stable était comparable à celle observée dans les populations témoins. C pneumoniae circulant était fortement associé à la variabilité saisonnière

Chlamydia pneumoniae est un pathogène intracellulaire qui est une cause fréquente d’infections des voies respiratoires dans le monde Plus de% des adultes sont infectés par C pneumoniae au cours de leur vie, et les réinfections sont fréquentes Depuis le rapport de Saikku et al décrivant des titres élevés d’IgG et les anticorps IgA contre C pneumoniae chez les patients avec infarctus du myocarde récent et la coronaropathie chronique CAD, de nombreuses études ont été réalisées pour clarifier la relation entre C pneumoniae et athérosclérose C pneumoniae a été détectée dans les lésions athéroscléreuses humaines par PCR , immunohistochimie , microscopie électronique , et la culture cellulaire , quoique à des taux variables En outre, des pathogènes viables ont été récupérés de lésions athérosclérotiques dans les artères coronaires et les artères carotides Plusieurs études in vitro ont démontré que C pneumoniae infecte les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les macrophages et se reproduit en leur sein. n et al ont démontré que l’infection intranasale par C pneumoniae provoque des modifications inflammatoires de l’aorte sous-cutanée dans l’aorte des lapins. Dans un modèle murin, Moazed et al ont démontré que l’infection par C pneumoniae se dissémine systématiquement par voie sanguine après infection des macrophages alvéolaires. Les chercheurs ont proposé que C pneumoniae continue de vivre dans les macrophages et migre avec eux dans la paroi artérielle D’autres chercheurs ont examiné la relation entre l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC et CAD , l’athérosclérose carotidienne , les anévrismes aortiques,, Malgré ces données, on ne sait pas encore si la présence d’ADN de C pneumoniae dans les PBMC peut être un indicateur utile de la CAO. Le but de cette étude était donc de clarifier la relation entre l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC et la CAD stable. ou ACS coronaire aigu chez les adultes japonais En outre, nous avons examiné la présence ou l’absence de variabilité saisonnière dans le pré valence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC

Matériaux et méthodes

Des échantillons sanguins ont été prélevés sur des sujets tous les mois pour évaluer les changements temporels de la prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC. Les sujets étaient des personnes recrutées dans la première partie de l’étude de janvier à mars et qui ont pu voir un médecin AT au moins une fois par mois pendant l’année La sélection du sujet a été achevée avant l’obtention des résultats de la première partie de l’étude. Un patient a abandonné avant la fin de l’étude. l’étude Tous les protocoles d’étude étaient en accord avec les directives du comité d’éthique de notre établissement, et le consentement éclairé a été obtenu pour chaque patient avant l’étude. La PCR PCR a été réalisée selon la méthodologie décrite par Dowell et al. chaque patient a été recueilli dans des tubes traités à l’EDTA Des échantillons de sang ont été prélevés à l’admission à h SCA, patients atteints de coronaropathie stable et sujets témoins sans anomalie sur les artériographies coronaires Des échantillons sanguins pour PCR nested touchdown ont été traités selon la méthode décrite par Condos et al Des échantillons de sang ont été soigneusement étalés sur Separate-L Muto Pure Chemicals La couche leucocyto-plaquettaire a été obtenue par centrifugation g pendant min, décollée, puis lavée avec de la solution saline tamponnée au phosphate pendant min., puis mise en circuit avec un volume total de ml. élué à pL de PBS et transféré dans un nouveau tube pour l’extraction de l’ADN. L’ADN a été extrait des PBMC en utilisant un ADN minikit QIAamp; Qiagen conformément aux instructions du fabricant L’ADN a été élué à un volume final de μL et stocké à – ° C Avant d’effectuer la PCR, la concentration de l’ADN a été analysée par photométrie optique, nm La moyenne des déterminations a été utilisée a été réalisée comme décrit par ailleurs par Tong et Sillis et Mahony et al . Le gène codant pour la protéine majeure de la membrane externe ompA a été amplifié. La paire externe d’amorces CP-, ‘-TTACAAGCCTTGCCTGTAGG-‘; CP-, ‘-GCGATCCCAAATGTTTAAGGC-‘ étaient communs à la fois au gène ompA de C pneumoniae et à Chlamydia psittaci, et à la paire interne d’amorces CPC, ‘-TTATTAATTGATGGTACAATA-‘; CPD, ‘-ATCTACGGCAGTAGTATAGTT-‘ étaient spécifiques d’un domaine variable du gène ompA de C pneumoniae Les amorces externes amplifient un fragment -bp, alors que les amorces internes amplifient un fragment -bp La réaction d’amplification est réalisée dans un volume de μL contenant μg d’ADN extrait, mmol / L Tris HCl pH,, mmol / L KCl, et une concentration de -mol / L de désoxynucléoside triphosphates Le rapport d’un volume d’ADN matrice au volume de mélange réactionnel a été déterminé comme indiqué par Mahony et al. Les conditions de PCR nichées au toucher étaient les suivantes: le premier cycle d’amplification employé mmol / L MgCl, les amorces umol / L et l’U de l’ADN polymérase Perkin-Elmer d’AmpliTaq Gold et les cycles impliqués de min à ° C, min à ° C ont diminué de ° C par cycle, et min à ° C, plus des cycles supplémentaires de min à ° C, min à ° C et min à ° C Les produits de PCR amplifiés par les amorces externes CP – CP – ont été filtrés par une microcon-PCR Millipore, et un volume de μL a été ajouté à un nouveau ra seconde amplification Le deuxième cycle d’amplification employait mmol / L MgCl, amorces umol / L, et U de l’ADN polymérase AmpliTaq Gold et impliquait des cycles de min à ° C, min à ° C, et min à ° C Les produits d’amplification étaient visualisés en% d’agarose avec coloration au bromure d’éthidium par des techniques standard L’ADN purifié de C pneumoniae de la souche YK- a été utilisé comme témoin positif La limite inférieure de détection de la PCR était des unités formant inclusion. La PCR a également été réalisée avec des amorces pour une séquence du gène β-globine confirmer que la quantité totale d’ADN de chaque échantillon était similaire et qu’aucun faux négatif n’a été généré Pour éviter le risque de contamination, toutes les réactions ont été effectuées dans des conditions rigoureuses. L’ADN, l’amplification PCR, l’amplification PCR et l’électrophorèse ont été réalisées dans des pièces séparées. Des pointes de pipettes à barrière aérosol, des couches de laboratoire dédiées et des gants ont également été utilisés. Quatre contrôles négatifs, constitués d’eau distillée stérile à la place de l’échantillon clinique, ont été effectués avec tous les échantillons pour toutes les réactions Deux groupes de témoins négatifs ont été incorporés au stade de l’extraction d’ADN et des témoins négatifs supplémentaires ont été ajoutés pendant les première et deuxième étapes de PCR. Validité de notre méthode PCR par des tests PCR répétés et séquençage de produits PCR positifs, respectivementAnalyse des données Les données sont exprimées en moyenne ± SD ou en pourcentage Les données catégorielles ont été analysées par le test exact de Fisher ou par le test with avec correction de Yates. par le test t non apparié ou par l’analyse de variance de la valeur de AP de variance de & lt; a été considéré comme statistiquement significatif

Résultats

La prévalence de C pneumoniaeDNA dans PBMCsTable montre les caractéristiques des populations étudiées incluses dans la première partie de l’étude La fréquence des personnes atteintes de diabète sucré et d’ex-fumeurs était significativement plus élevée chez les patients atteints de SCA que chez les sujets témoins. il n’y avait pas de différence significative dans la prévalence de l’ADN de C pneumoniae positif dans les PBMCs en comparant les groupes de patients avec ACS, [%] de; patients avec CAD stable, [%] de; et sujets témoins, [%] de

Tableau View largeTélécharger slideCaractéristiques des sujets dans une étude de la prévalence de l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les PBMCTable View largeTélécharger slideCaractéristiques des sujets dans une étude de la prévalence de l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les PBMCModifications temporelles de la prévalence deC pneumoniaeDNA dans les PBMCsTable montre les caractéristiques des populations étudiées inclus dans la deuxième partie de l’étude Il y avait une proportion significativement plus élevée d’ex-fumeurs parmi les patients atteints de coronaropathie que parmi les sujets témoins% vs%; P & lt; Comme l’illustre la figure, il n’y avait pas de différence significative dans la prévalence de l’ADN C pneumoniae-positif dans les PBMC lors de la comparaison des patients avec CAD avec des sujets témoins dans les différentes périodes de janvier à mars, [%] vs [%]; D’avril à juin, [%] de vs [%] de; Juillet à septembre, [%] de vs [%] de; Cependant, la prévalence de l’ADN positif au C pneumoniae dans les PBMC était plus élevée au cours du premier mois de janvier à mars qu’au cours des autres mois, tant chez les patients atteints de coronaropathie que chez les patients sujets témoins P & lt; Le taux d’ADN positif de C pneumoniae dans les PBMC a diminué après avril, surtout en septembre et en octobre, mais il a augmenté après le mois de novembre.

Tableau View largeTélécharger slideCaractéristiques des sujets dans une étude des changements temporels de la prévalence de l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les PBMCsTable View largeTélécharger slideCaractéristiques des sujets dans une étude des changements temporels de la prévalence de l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les PBMC

Figure View largeDownload slideModifications temporelles de la prévalence de l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les PBMC chez les patients atteints de coronaropathie et chez les sujets témoins * P & lt; versus janvier à mars chez les patients atteints de coronaropathie; ** P & lt; versus Janvier à Mars chez les sujets témoinsFigure View largeTélécharger la lameLes changements temporels dans la prévalence de l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les PBMC chez les patients atteints de coronaropathie CAD et chez les sujets témoins * P & lt; versus janvier à mars chez les patients atteints de coronaropathie; ** P & lt; versus janvier à mars chez les sujets témoins

Figure vue largeTarque de téléchargement de l’ADN Chlamydia pneumoniae-positif dans les PBMC par mois chez les patients atteints de coronaropathie CAD et chez les sujets témoinsFigure View largeTélécharger la diapositive de Chlamydia pneumoniae ADN positif dans les CMSP par mois chez les patients atteints de coronaropathie CAD et chez les sujets témoins les sujets, les patients avec CAD et les sujets témoins ont eu des résultats de tests de PCR négatifs persistants; les patients atteints de coronaropathie et les sujets témoins ont eu un résultat positif au test PCR, les sujets atteints de CAD et les sujets témoins ont eu des résultats positifs au test PCR, et les sujets atteints de CAD et de sujets témoins ont eu des résultats positifs. sujets% avaient une table de test PCR positive

Tableau View largeTélécharger les résultats des tests PCR périodiques pour les patients atteints de coronaropathie CAD et contrôle sujetsTable Voir grandDownload slideSerial Résultats des tests PCR pour les patients atteints de coronaropathie CAD et contrôleRéproductibilité et validité de la méthode PCR Pour examiner la reproductibilité de notre méthode PCR, chaque PCR Les échantillons ont donné des résultats positifs et les échantillons ont donné des résultats négatifs. % d’échantillons Pour examiner la validité de notre méthode de PCR, les échantillons qui ont eu des résultats positifs dans la première série ont été séquencés, et tous étaient compatibles avec la séquence cible dans l’ADN de C pneumoniae.

Discussion

La relation entre C pneumoniaeDNA dans PBMCs et CAD Tableau montre la relation entre l’ADN de C pneumoniae dans PBMCs et CAD Le rapport de Boman et al a été le premier à suggérer une relation entre l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC et CAD. En revanche, Wong et al ont rapporté que la prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC était significativement plus élevée chez les hommes que chez les hommes. avec la coronarographie confirmée angiographiquement que chez ceux ayant des coronaires normaux% vs% et a conclu que la présence d’ADN circulant de C pneumoniae était un prédicteur de la coronaropathie plus forte que tous les facteurs de risque connus, tels que le tabagisme, l’hypercholestérolémie, l’hypertension, le diabète sucré et antécédents familiaux de CAO OU; % CI, – Sessa et al ont récemment rapporté que la prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC était significativement plus élevée chez les patients atteints de SCA que chez les sujets sains% vs%

Diapositives décrivant la relation entre l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les PBMC et la coronaropathie CADTable View largeTélécharger les études décrivant la relation entre l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les PBMC et la coronaropathie CADDans la présente étude, il n’y avait pas de différences significatives dans la prévalence de C pneumoniae ADN dans les PBMC lors de la comparaison des patients avec SCA, ceux avec CAD stable, et les sujets témoins Il existe plusieurs explications possibles des différences entre les études publiées, y compris la présente étude. Chaque étude implique des populations de patients uniques qui peuvent avoir des différences dans la relation entre Ainsi, la variabilité intergroupe potentielle dans le temps où des échantillons de sang ont été obtenus peut conduire à des différences intergroupes dans la prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMCs et CAD. PBMC dans Dans la présente étude, il n’y avait pas de différences significatives dans la prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC au cours d’une période de un mois lors de la comparaison des patients avec CAD et des sujets témoins. L’ADN circulant du C pneumoniae ne serait pas un indicateur utile de la variabilité saisonnière. La prévalence de C pneumoniaeDNA dans les PBMCsTable montre la variation saisonnière de la prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC Des différences inter-menstruelles dans la prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC ont été suggérées par des études antérieures [, -] Smieja et al. En hiver et au printemps, Rassu et al ont trouvé une prévalence plus élevée d’ADN de C pneumoniae dans les PBMC en février qu’en octobre% vs% En outre, Haranaga et al ont trouvé une prévalence plus faible d’ADN de C pneumoniae dans les PBMC en octobre et novembre qu’en août et septembre% vs% chez les donneurs de sang sains Dans la présente étude, la prévalence de l’ADN positif au C pneumoniae dans les PBMC était significative En outre, le taux d’ADN de C pneumoniae dans les PBMC a diminué après avril, en particulier en septembre et en octobre, mais il a augmenté après novembre. Ces données suggèrent que la prévalence L’ADN de C pneumoniae dans les PBMC a une variabilité saisonnière et est cohérent avec les études précédentes [,,] D’autres études sont nécessaires pour clarifier si cette variabilité saisonnière est due à une survenue saisonnière d’infections aiguës à C pneumoniae dans la communauté et si cette saisonnalité est un phénomène mondial

Diapositives décrivant la variation saisonnière de la prévalence de l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les PBMCTable View largeTélécharger les études décrivant la variation saisonnière de la prévalence de l’ADN de Chlamydia pneumoniae dans les PBMCSignificance de l’ADNc pneumoniae C dans les PBMC Bien que la présente étude indique L’infection par C pneumoniae peut contribuer au développement de l’athérosclérose en modulant l’interaction macrophage-lipoprotéine et en induisant l’expression de diverses cytokines [ ,], les molécules d’adhésion , et les chimiokines dans les cellules associées à l’athérome En outre, l’infection par C pneumoniae peut produire des procoagulants et déclencher une cytotoxicité endothéliale médiée par anticorps par une réaction croisée immunologique nos tests de PCR en série qui circu L’ADN de C pneumoniae était fréquemment détecté pendant l’hiver et au début du printemps et la majorité des sujets avaient un résultat positif au test PCR, la population japonaise semble avoir amplement l’occasion d’acquérir une infection vasculaire C pneumoniae qui peut contribuer au développement de l’athérosclérose. La présente étude présente plusieurs limites. Premièrement,% des sujets témoins n’ont pas subi d’artériographie coronaire et peuvent avoir eu une sténose artérielle coronaire significative mais asymptomatique Deuxièmement, la détection de l’ADN de C pneumoniae par PCR n’est pas une preuve définitive de la présence réelle de C pneumoniae Cependant, l’ADN de C pneumoniae mort dans les échantillons tissulaires est rapidement dégradé in vivo , et la détection de C pneumoniae dans les PBMC par PCR est reproductible et corrélée avec d’autres techniques de détection, comme la microscopie immunoélectronique et la culture. de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC reste incertain car nos sujets ne présentaient aucun symptôme de infection pulmonaire dans les semaines suivant l’obtention d’échantillons sanguins, une origine plausible peut être la dissémination systémique de C pneumoniae après infection pulmonaire aiguë C pneumoniae. En effet, les infections asymptomatiques de C pneumoniae peuvent être fréquentes résultat d’infections chroniques dans le poumon et le pharynx Quatrièmement, la prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC dans notre étude était plus élevée que dans d’autres rapports Bien qu’une épidémie d’infection à C pneumoniae ait pu conduire au La plus grande explication est que les premiers échantillons ont été obtenus en hiver et au début du printemps, lorsque la prévalence saisonnière semble être la plus élevée. La différence entre les taux de prévalence de C pneumoniae dans les PBMC n’a pas été démontrée. les méthodes de PCR utilisées pour la détection de C pneumoniae dans les PBMC peuvent également être une cause importante de la variabilité interétude de la prévalence de C Mahony et al ont récemment montré que la PCR nichée ompA utilisée dans notre étude était plus sensible à la détection de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC et avait des résultats plus reproductibles que les autres méthodes de PCR utilisées dans les études précédentes. Nous avons confirmé la reproductibilité et la validité de notre méthode de PCR. Par conséquent, nous croyons que la fiabilité de nos résultats est élevée. Conclusions La prévalence de l’ADN de C pneumoniae dans les PBMC chez les patients atteints de SCA ou de CAD stable est comparable à celui des sujets témoins dans la population adulte japonaise La présence d’ADN de C pneumoniae dans les PBMC ne devrait pas être un indicateur de SCA ou de coronaropathie. Il semble plutôt s’agir d’un phénomène saisonnier, avec une prévalence plus élevée en hiver et au début du printemps. Adultes japonais

Remerciements

Nous remercions le Dr Oren Traub pour son aide dans la lecture et l’édition de ce manuscritConflit d’intérêt Tous les auteurs: Pas de conflit