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Identification de ML251, un puissant inhibiteur de T. brucei et T cruzi Phosphofructokinase

Tuesday, April 10th, 2018 | Lea | Santé publique

Trypanosomiase humaine africaine

(THA), également connu sous le nom de maladie du sommeil, est une maladie causée par le

protiste parasite, Trypanosoma brucei, et est endémique

en Afrique subsaharienne. Plus de 60 millions de personnes sont estimées

être à risque d’infection par la THA, en raison de l’infestation généralisée de

le vecteur de la mouche tsé-tsé du parasite, ainsi que la densité de

les humains et les bovins dans la région, qui servent de réservoirs pour la

parasites causals.1,2 HAT est presque toujours mortel si

laissé non traité, et les thérapies classiques utilisées pour le traiter ont historiquement

souffert d’une gamme d’effets secondaires délétères, en partie à cause de

leurs mécanismes d’action non sélectifs et la plupart des thérapies approuvées

nécessitent une administration intraveineuse ou intramusculaire,

traitement de complication.3,4 HAT de deuxième stade, caractérisé

par l’infiltration de parasites dans le système nerveux central,

reste un défi particulier en raison de la nécessité de

molécules de traverser la barrière hémato-encéphalique du sang.5 En outre, la résistance croissante à ces médicaments a mis en évidence

L’enzyme glycolytique phosphofructokinase (PFK) a un besoin d’identification de nouvelles thérapies.

récemment été

reconnue comme une cible potentielle pour le traitement de T. brucei, car le stade sanguin infectieux du parasite dépend uniquement

sur le métabolisme du glucose pour la production d’ATP.7 − 10 PFK catalyse essentiellement

réaction irréversible dans des conditions physiologiques chez les parasites

et représente ainsi la première étape engagée de la glycolyse.11 En outre, la nécessité de la glycolyse pour

la croissance du parasite a été confirmée par un knockdown médié par siRNA; une

Une diminution de 50% du flux glycolytique s’est révélée suffisante pour

diminution de la viabilité des parasites, ce qui suggère en outre que

la glycolyse peut être une stratégie viable pour la thérapie HAT.9 Actuellement, aucun inhibiteur de Tb PFK n’a

ont été décrits qui démontrent la puissance submicromolaire ou la sélectivité

pour l’enzyme. Les inhibiteurs signalés comprennent la suramine, un antitrypanosome classique

médicament en usage depuis 1920 avec une activité promiscuous noté, inhibant

80 essais parmi 370 testés dans PubChem (IC50 ≤ 1

μ M dans 26 tests), ainsi qu’un analogue à base de furanose rapporté

par Nowicki et al. avec une IC50 de 23 μ M (Figure ​ (Figure11) .11,12Figure 1 (a) Structures chimiques des inhibiteurs de Tb PFK suramin,

un analogue glycosidique, et notre hit qHTS (1). Le composé 1 est un dérivé évident de l’antibiotique sulfaméthoxazole,

qui ne montre aucune activité inhibitrice contre PFK. (b) Route synthétique

à 1, qui était … Nous rapportons ici la découverte et la structure – activité

relation

(SAR) de nouveaux inhibiteurs puissants de T. brucei et T. cruzi PFK. Une bibliothèque de 330 683 composés

du référentiel des petites molécules des bibliothèques moléculaires (MLSMR, http://mli.nih.gov/mli/compound-repository/mlsmr-compounds/) a été examiné à 6 concentrations (couvrant une plage de concentration

de 57,5 ​​μ M à 3,7 nM) contre la TK PFK recombinante pour l’activité inhibitrice.13 Activité PFK

a été évaluée en couplant la production d’ADP médiée par PFK à une modification

test de détection basé sur la luciférase (ADP-Glo), fournissant un luminescent

lecture du point final. Une description par étapes du test 1536 puits est

montré dans le tableau supplémentaire 1. Complet

des données de dépistage et de suivi ont été mises à disposition dans PubChem (PubChem

Identificateur de résumé BioAssay 488768; http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi?aid=488768). Confirmation de succès subséquente avec un système de réduction de l’ATP orthogonal

dosage (description dans le tableau supplémentaire 2, données non présentées) a conduit à l’identification de l’échafaudage para-amidosulfonamide comme l’une des séries à succès, caractérisée par

le coup de criblage (1) avec une CI50 de 1.1

μ M (Figure ​ (Figure1) .1). Alors que 1 contient

le même noyau que l’antibiotique sulfaméthoxazole, ce dernier montre

pas d’activité inhibitrice contre T. brucei PFK. La resynthèse de 1 est montrée sur la figure ​ Figure1b1b et a suivi une séquence simple de formation de sulfonamide,

l’hydrolyse de l’acétyle catalysée par un acide, et finalement la formation d’un amide. Heureusement,

la version resynthétisée avait une CI50 de 410 nM (Tableau 1). Bien que l’original

campagne de dépistage a été conçue pour identifier les inhibiteurs de PFK chez T. brucei, l’organisme apparenté, Trypanosoma cruzi, responsable de la maladie de Chagas, possède une

Génération d’ATP par la glycolyse; les isoformes de T. brucei et T. cruzi PFK présentent 77% d’identité de séquence globale,

avec plus de 90% d’identité de séquence dans le site actif.14 A ce titre, la stratégie générale de synthèse

dans la figure ​ Figure1b1b a été utilisé pour initier la synthèse,

tous les analogues étant testés contre les isoformes de T. brucei et de T. cruzi PFK. Le SAR a suivi très

bien avec quelques exceptions entre les espèces, bien que la discussion

de SAR ici se concentrera uniquement sur l’activité de T. brucei.

Les premiers changements tentés étaient de comprendre si nous pouvions modifier

le noyau de para-amidosulfonamide (Tableau 1). L’arrangement de 1,4-disubstitution sur le cycle phényle prouvé

être optimal car l’analogue méta-substitué (2) souffrait d’une activité fortement diminuée. Essayer de

changer pour saturé (3), chaîne alkyle (4),

et les noyaux hétéroaryle (5) ont tous abouti à moins actif

analogues. Cette première série de SAR a conclu avec des efforts pour comprendre

l’importance des liaisons de sulfonamide et d’amide. SAR très serré

a été observée en ce qui concerne ces deux fonctionnalités, comme indiqué

dans les analogues 6 – 12.Table 1SAR Évaluer le noyau des inhibiteurs de PFK Comme un certain nombre de coups de l’écran quantitatif à haut débit

(qHTS), ainsi que l’analogue de furanose rapporté par Nowicki,

contient le motif 3,4-dichlorobenzyle présent en 1,

nous voulions tester le rôle de ces substituants pour l’activité inhibitrice

(Tableau 2). Tandis que

les délétions à un ou deux points des groupes chloro ont conduit à

composés moins actifs (13 – 15), nous

réalisé que la substitution de chloro à la position 3 ou 4 contribué

significativement à la puissance que l’analogue phényle était 5 et 20 fois

moins puissants que les analogues 4- et 3-chloro, respectivement, pour T. brucei. En utilisant cette information, nous avons ensuite synthétisé

peu d’analogues avec des substituants p-halo ou -méthyle

et ont trouvé que les analogues de p-halo (17 – 19) avaient une activité similaire entre eux et

activité légèrement diminuée par rapport à l’analogue dichloro. L’analogue de p-méthyle (20) a montré un ∼ 8 fois

perte de puissance par rapport à 18 soulignant l’importance

de ces halogènes en position 4. D’autres manipulations de ces

3,4-substituants ont conduit à une perte significative ou une perte complète de

activité (21 – 24). Enfin, suppression,

l’extension, et la substitution du groupe méthylène benzylique

dans les puissances réduites (25 – 27) .Table 2SAR évaluant le groupe benzylique de

Inhibiteurs de PFK Réalisant que le modèle de substitution 3,4-dihalo était la clé pour

activité, ce motif a été poursuivi à un cycle supplémentaire d’analogues

visant à enquêter sur le SAR autour de la fraction isoxazole en utilisant le

la chimie représentée sur la figure ​ la figure 1c1c (tableau 3). Fait intéressant, sulfonique

l’analogue acide 28 avait une activité submicromolaire tandis que le

plus analogue phényle hydrophobe (29) perdu considérable

activité. L’analogue 5-des-méthyle 30 (ML251) a montré une légère amélioration de la puissance

au coup 1 et nous a conduit à l’hypothèse que les analogues

avec des donneurs / accepteurs de liaisons hydrophiles et / ou hydrogènes à cette position

peut conduire à une amélioration de l’activité. Par conséquent, nous avons synthétisé des analogues contenant divers hétérocycles

et des groupes phényle substitués. Alors que les analogues de pyrazole 31 et 32 ​​ont une activité appréciable, un saut significatif

en puissance contre PFK des deux espèces a été observée pour le carboxylique

acides 33 et 35. Fait intéressant, le parent

l’ester (34) n’a pas d’activité inhibitrice. Pyrimidine, phénol,

et les analogues contenant de l’aniline ont tous montré une activité diminuée, ce qui nous a amenés à

analogues hétérocycliques. Passage de l’isoxazole à un thiazole

ont entraîné une amélioration de l’activité des analogues 39 et 40 ayant respectivement une activité de 79 et 24 nM pour T. brucei et de 41 et 120 nM pour T. cruzi, respectivement. L’analogue de thiadiazole (41) n’a vu que

une très légère diminution de l’activité contre T. brucei et T. cruzi par rapport à 39. Fait intéressant,

l’analogue thiadiazole avec le schéma de substitution 4-chloro-3-fluoro

(42) a donné l’analogue le plus puissant contre T.

brucei à (IC50 = 15 nM), tandis que 39 restait l’inhibiteur le plus puissant de T. cruzi (IC50 = 41 nM) .Table 3SAR de l’hétérocyclePour identifier le mécanisme d’action de ce chimiotype para-amidosulfonamide, des études de compétition ont été réalisées par

titrage des substrats individuels et de l’analogue de thiadiazole puissant, 42, en utilisant un dosage couplé biochimique PFK. Lineweaver – Burk

les transformations des vélocités initiales suggèrent que 42 s’engage dans la compétition pour la liaison avec le fructose 6-phosphate (F6P)

(Figure ​ (Figure2a), 2a), tout en démontrant une inhibition mixte

par rapport à l’ATP (Figure ​ (Figure2b) .2b). Détermination

des constantes d’inhibition pour 42 contre PFK pour F6P a montré

un Ki de 52 nM (Figure supplémentaire 1a), tandis que l’ATP (sous saturation

Niveaux F6P) diminue encore l’affinité de 42 par 4,5 fois

(Ki ′ = 240 nM, Figure supplémentaire 1b). En effet, des études antérieures

ont montré que T. brucei PFK subit une conformation

transition sur la liaison ATP, induisant un changement significatif dans la

site actif, ce qui peut contribuer à l’affinité réduite de ces

inhibiteurs en présence d’ATP.10

cette vue, notre étude est compatible avec les inhibiteurs se liant à

l’enzyme libre et l’activité inhibitrice par la concurrence directe

avec F6P. La similitude du motif 3,4-dichlorobenzyle dans nos inhibiteurs

avec les analogues du furanose signalé par Nowicki prend également en charge l’interaction

avec la poche de sucre et notre enzyme.Figure 2Evaluation du mécanisme

d’action de l’analogue de para-amidosulfonamide 42. Lineweaver – les transformations de Burk de la vitesse initiale

sont montrés pour (a) F6P et (b) ATP, démontrant compétitif et mixte

modes d’inhibition, respectivement. Le second (sans titre) … Typifié par 30 et 42, comparable

inhibiteur

l’activité a été observée chez T. brucei et T.

cruzi PFK isoforms (Figure ​ (Figure2c), 2c), et

cette tendance a été anticipée car ces isoformes affichent une séquence significative

identité (voir plus haut) .11 En outre, de

les analogues ont montré une augmentation de la puissance par rapport à l’isoforme de T. cruzi par rapport à T. brucei, suggérant que

cette série peut trouver une utilité supplémentaire en dehors de T. brucei seul. De façon encourageante, 42 a été testé à 1 μ M contre

l’isoforme de lapin de PFK et n’a montré aucune inhibition significative (figure supplémentaire 2). Ces données suggèrent que

une fenêtre significative de sélectivité existe pour ce chémotype, et

important, un isoforme mammifère de l’enzyme ne semble pas sensible

à l’inhibition. Ceci est d’une importance particulière pour la THA potentielle

thérapies, comme la promiscuité entre espèces et la polypharmacologie continuent

de nombreux traitements de première ligne actuellement utilisés pour traiter la trypanosomiase

(par exemple, suramine). Une validation supplémentaire de ce chémotype a été réalisée

en évaluant

toxicité dans la forme sanguine de T. brucei (souche Lister 427)

cultures in vitro. Cette sous-espèce, bien qu’elle ne soit pas infectieuse pour l’homme, est

fortement apparenté à la sous-espèce causale de la THA T. b. gambiense et T. b. rhodesiense et est donc communément

utilisé comme modèle dans les paramètres de laboratoire. L’activité d’un sous-ensemble d’analogues de para-amidosulfonamide a été déterminée (figure ​ (figure2d), 2d), et une toxicité dose-dépendante modeste a été observée

avec les deux 1 (DE50 = 15,18 μ g / mL / 26,8

μ M) et 30 (DE50 = 7,24 μ g / mL / 16,3

μ M). L’analogue le plus puissant du test enzymatique PFK, 42, n’a montré aucune toxicité

on ne sait pas si le manque d’activité est due à un mauvais composé

perméabilité ou diminution de la puissance / liaison contre la cible dans le

parasite. Ces composés ont également été testés pour leur toxicité

la lignée de cellules pulmonaires humaines MRC-5, un substitut couramment utilisé pour les humains

toxicité de l’hôte. Aucune toxicité appréciable n’a été observée à aucune concentration

de composé (ED50 > 20 μ g / mL / 46 μ M), suggérant

que ces composés n’exercent aucun effet hors cible ou PFK

dans un environnement cellulaire humain. Il convient de noter que la réduction globale

en puissance par rapport au test primaire a été prévu, comme plusieurs

des études ont montré une traduction du parasite enzymatique au parasite cultivé

Les dosages sont souvent accompagnés d’une perte d’activité significative.15,16 Nous avons également évalué ces analogues sélectionnés via ADME in vitro.

dosages

évaluer la solubilité aqueuse, la stabilité chez la souris, le rat et l’humain

les microsomes du foie et la stabilité du plasma (Tableau 4). Mis à part une responsabilité dans les microsomes de rat pour l’analogue 1 (t1 / 2 = 9,7 min), aucun des analogues

ont montré des problèmes majeurs avec tous ayant une très bonne solubilité aqueuse.Table 4Sélectionnez in vitro Propriétés ADME pour 1, ML251, et 42Le chémotype para-amidosulfonamide, exemplifié

par 30 et 42, représentent le premier petit

les molécules possèdent une activité inhibitrice submicromolaire contre T. brucei et T. cruzi PFK. De plus, 1 et 30 avaient une activité micromolaire en culture

essais de croissance parasitaire. Ceci, couplé avec notre mécanique et sélectivité

données, fournit la première preuve qu’une inhibition spécifique de T. brucei PFK par une petite molécule peut être réalisée. Enfin,

les membres de cette série ont démontré des propriétés encourageantes dans

un panel de tests d’évaluation ADME in vitro. En tant que tels, ils représentent

outils utiles pour faire avancer notre compréhension du rôle que PFK et

le jeu de la glycolyse dans l’infection trypanosomienne. | ​​n | aucun